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CeNS Center for NanoScience LMU Ludwig-Maximilians-Universität München
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Auf dem Weg zu molekularer Auflösung mit blinkenden Molekülen

Kleinste Strukturen im Inneren einer Zelle sichtbar zu machen und beobachten zu können, ist ein wichtiger Aspekt biologischer Forschung. Eine leistungsstarke Methode hierfür ist die Fluoreszenzmikroskopie, deren Auflösungsvermögen jedoch aufgrund der Beugung des Lichts begrenzt ist: Möchte man etwa eine winzige punktförmige Lichtquelle wie z.B. die eines fluoreszierenden Moleküls mit einer Größe von ca. einem Nanometer (einem Milliardstel Meter) abbilden, so sieht man statt dessen einen unscharfen kreisförmigen Fleck mit einem Durchmesser von mindestens 200 Nanometern (nm). Liegen nun zwei Moleküle weniger als 200 nm voneinander entfernt, so überlagert sich das Licht dieser einzelnen Punktquellen zu verschwommenen Strukturen. Dies zeigt Abbildung 1A sehr deutlich: die in Wirklichkeit nur 7 nm breiten Aktinfilamente erscheinen in dem Bild sehr viel dicker, nämlich als längliche Strukturen mit einer Dicke von ca. 500 nm.

Erst kürzlich konnte nun gezeigt werden, dass diese Beschränkung der Auflösung mit Hilfe neuer Techniken überwunden werden kann. Eine Methode besteht darin, nacheinander die Position vieler einzelner Moleküle zu bestimmen und daraus ein Fluoreszenzbild zu rekonstruieren. Kann nämlich vorausgesetzt werden, dass das bildgebende Licht von einem einzigen fluoreszierenden Molekül stammt, so lässt sich dieses präzise orten: Es befindet sich schlicht genau in der Mitte des ~200 nm großen beobachteten Lichtpunktes. Nun muss sichergestellt sein, dass in einer Struktur, die oft aus vielen hundert Proteinmolekülen besteht, im kritischen Bereich von ca. 200 nm x 200 nm zu jedem Zeitpunkt höchstens ein Molekül leuchtet. Dies kann zum Beispiel erreicht werden, indem man Farbstoffe einsetzt, deren Leuchten sich mit Hilfe von Licht ein- und ausschalten lässt. Somit können mehrere Farbstoffmoleküle, obwohl sie sich alle im kritischen Bereich befinden, präzise lokalisiert werden, indem man sie einzeln nacheinander zum Leuchten bringt. Leider standen bislang nur wenige dieser „schaltbaren“ Farbstoffmoleküle zur Verfügung, was eine bedeutende Einschränkung dieser ansonsten sehr vielversprechenden Methode darstellt. Forscher des Center for NanoScience (CeNS) in München haben jetzt eine Möglichkeit gefunden, viele der gängig in der Biologie eingesetzten Farbstoffe für diese Mikroskopietechnik jenseits der klassischen Auflösungsgrenze nutzbar zu machen.

 

Abbildung: © J. Am. Chem. Soc., 130 (50), pp 16840 (2008)

Abbildung 1: Herkömmliches Fluoreszenzmikroskopie-Bild (A) und “Blink Mikroskopie”-Bild (B) von Aktinfilamenten auf einer Glasoberfläche. Die tatsächliche Breite der Filamente beträgt wenige Nanometer. Das rechte Bild kommt der Realität deutlich näher und lässt Details erkennen, welche im herkömmlichen Bild nicht aufgelöst werden können

 

 

Christian Steinhauer, Stipendiat des Internationalen Doktorandenkollegs „NanoBioTechnologie“ und Doktorand in der Arbeitsgruppe von Prof. Tinnefeld, nutzt hierfür eine ansonsten unerwünschte Eigenschaft dieser Farbstoffe: Wie bei einem Wackelkontakt einer Glühbirne ist das Leuchten dieser Farbstoffmoleküle immer wieder unterbrochen – d.h. die Moleküle „blinken“. Diese Dunkelzustände werden zum Beispiel dadurch ausgelöst, dass reversible Elektronentransferreaktionen in den angeregten Zuständen stattfinden. Für die meisten Anwendungen ist dieses Phänomen äußerst unerwünscht, da man normalerweise eine kontinuierliche Fluoreszenz benötigt. Christian Steinhauer und seinen Kollegen ist es nun durch ein genaueres Verständnis der Farbstoffe gelungen, diese Dunkelzustände in ihrer Häufigkeit und Dauer präzise einzustellen. Dank dieser Technik ist es jetzt möglich geworden, einen Großteil der Moleküle zu einem bestimmten Zeitpunkt in einen Dunkelzustand zu versetzen. Damit können in diesem Moment die Positionen der wenigen noch leuchtenden Moleküle genau bestimmt werden. Ein auf diese Weise erhaltenes Fluoreszenzbild ist in Abb. 1B gezeigt (publiziert in J. Am. Chem. Soc. 130, 16840, 2008). Es zeigt deutlich die erhebliche Verbesserung der Auflösung der beobachteten Aktinfilamente im Vergleich mit der Aufnahme mittels der herkömmlichen Mikroskopie, welche in 1A gezeigt wird.

Diese neuentwickelte Mikroskopietechnik wird als „Blink Mikroskopie“ bezeichnet. Zusammen mit Computersimulationen konnte gezeigt werden, dass eine Auflösung von 50 nm möglich ist, was eine vierfache Verbesserung des Auflösungsvermögens bedeutet. Da auch Moleküle mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben ein solches Blinkverhalten zeigen, können mehrere Strukturen mit verschiedenen Farbstoffen simultan untersucht werden, was auch einen bedeutenden Vorteil darstellt. Zudem ist die Blink Mikroskopie durch die Geschwindigkeit des Blinkens die derzeit schnellste Superauflösungs-Mikroskopie, die auf der sukzessiven Ortsbestimmung einzelner Moleküle beruht.

 

Publikation:
"Superresolution Microscopy on the Basis of Engineered Dark States"
C. Steinhauer, C. Forthmann, J. Vogelsang and P. Tinnefeld
J. Am. Chem. Soc., 130 (50), pp 16840 (2008)

Christian Steinhauer
Ausbildung

Seit 2007
Doktorand in der Gruppe von
Prof. Philip Tinnefeld, jetzt: TU Braunschweig

2002 - 2007
Diplom in Molekularer Biotechnologie an der Universität Bielefeld und der University of Adelaide, Australien

Ausgewählte Publikation

J. Vogelsang, R. Kasper, C. Steinhauer, B. Person, M. Heilemann, M. Sauer, P. Tinnefeld:
"A reducing and oxidizing system minimizes photobleaching and blinking of fluorescent dyes
"
Angew Chem Int Ed, 47(29): 5465-5469 (including cover picture)